Печать

Этап №2 Изготовление и исследовательские испытания экспериментального образца программно-аппаратного комплекса

Cоглашение № 075-15-2019-061 (внутренний номер соглашения 14.607.21.0202)

Номер гос. регистрации АААА-А18-118121090018-8

Уникальный идентификатор проекта RFMEFI60718X0202

Приоритетное направление: Индустрия наносистем (ИН)

Критическая технология: Технологии получения и обработки функциональных наноматериалов

Период выполнения: 31 мая 2018 г. – 31 декабря 2020 г.

Получатель субсидии: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Пермский федеральный исследовательский центр Уральского отделения Российской академии наук (ПФИЦ УрО РАН)

Индустриальный партнер: Акционерное общество «Производственное объединение «Уральский оптико-механический завод им. Э.С. Яламова» (АО «ПО «УОМЗ»)

Ключевые слова: РАННЯЯ ДИАГНОСТИКА, ПРОТИВООПУХОЛЕВЫЕ ПРЕПАРАТЫ, ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПРЕПАРАТОВ,
КЛЕТОЧНЫЙ АНАЛИЗ, РАКОВЫЕ КЛЕТКИ, ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫЕ ОПУХОЛИ, КОМПЬЮТЕРНАЯ ОБРАБОТКА,
ИНТЕРФЕРЕНЦИОННЫЕ ИЗОБРАЖЕНИЯ, ЛАЗЕРНАЯ МИКРОСКОПИЯ, ИНФРАКРАСНАЯ ТЕРМОГРАФИЯ,
ФЛЮОРЕСЦЕНТНАЯ МИКРОСКОПИЯ, НАНОПОРИСТЫЕ И МИКРОПОРИСТЫЕ НОСИТЕЛИ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ
ПРЕПАРАТОВ, ПРОЛОНГИРОВАННОЕ ВЫСВОБОЖДЕНИЕ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

1 Цель проекта

Реализация проекта направлена на решение социально-значимой проблемы создания отечественных программно-аппаратных средств и методик для высокоинформативной и достоверной ранней диагностики злокачественных новообразований, обеспечивающих импортонезависимость российского здравоохранения и имеющих экспортный потенциал.

Целью реализуемого проекта является создание обладающего экспортным потенциалом отечественного программно-аппаратного комплекса на базе лазерного модуляционного интерференционного микроскопа, оригинальных методик флюоресцентного и термографического анализа для ранней диагностики злокачественных опухолей, оценки эффективности противоопухолевых препаратов с целью обеспечения импортонезависимости.

2 Основные результаты проекта

Выполненный патентный и аналитический обзор более 100 научно-информационных литературных источника за 2013–2017 гг. в технической области методов диагностики злокачественных новообразований и оценки эффективности действия противоопухолевых препаратов с использованием лазерной микроскопии, термографического анализа, флуоресцентного анализа, позволил выбрать и сформулировать направления исследований и возможные варианты технических решений. В результате исследований разработаны методы: термографической съемки молочной железы с использованием блока ТГД ПАК и предварительной обработки тепловых изображений молочной железы. Предложен критерий классификации нормальной и раковой ткани молочной железы. Определен критерий дифференциации раковых и нормальных эпителиальных клеток выделенных из одного источника (ткани, органа), базирующийся на оценке морфометрических параметров фазовых изображений клеток, полученных с помощью метода ЛИМ. Создана методика анализа динамики изображений лазерной интерференционной микроскопии и дифференциации нормальных и опухолевых клеток. Предложен критерий дифференциации нормальных и опухолевых клеток устанавливающий, что эпителиальная клетка человека считается опухолевой, если значение показателя Хёрста превышает значение 0,45 и ширина мультифрактального спектра равна 0. В противном случае клетка считается нормальной. С использованием разработанных в проекте компьютерных моделей поровой структуры созданы методики получения пористых носителей лекарственных препаратов на основе пористых кремния и кальций-фосфатного покрытия для экспресс-оценки эффективности противоопухолевых препаратов. Разработана эскизная документация и изготовлен лабораторный стенд для оценки эффективности действия противоопухолевых препаратов методом ЛИМ ФПВК.941416.001. Разработаны макеты модуля флуоресцентного канала и револьверной головки блока ЛИМ ПАК, подготовлена эскизная конструкторская документация модулей, проведены их исследовательские испытания, подготовлены технические рекомендации для максимального интегрирования данных компонентов в систему ЛИМ ПАК.

Анализ измерений тестовых объектов показал, что, по сравнению со сканирующим интерференционным профилометром ZYGO NewView 5010, ЛИМ ПАК удовлетворяет требованиям техзадания по техническим характеристикам: обеспечивает лучшую разрешающую способность в плоскости (X, Y) и точность измерения высоты объектов с размером менее 1,5 мкм. Разработаны и испытаны программные модули обработки данных ПАК: инфракрасной термографии; флюоресцентного анализа клеток, динамики их изображений и морфометрии, которые позволяют загружать и сохранять: оптическое изображение клетки, выделять и загружать, фильтровать флюоресцентный образ клеток, а также загружать, восстанавливать фазовые сдвиги, удалять наклон, выделять контур фазового изображения, анализировать морфометрические показатели и флуктуации оптической толщины клеток. Методом ЛИМ с использованием пористых носителей препаратов разработана лабораторная методика оценки эффективности действия противоопухолевых препаратов, основанная на том, что эффективность действия препарата способствует повышению уровня апоптотических изменений в клетке и, как следствие, увеличению степени волнистости профиля ее фазовых изображений. Разработаны и изготовлены экспериментальные образцы, ЭКД модулей флюоресцентного анализа и револьверной головки блока ЛИМ ПАК, испытания которых подтвердили: стабильность работы системы переключения между увеличениями и разницу в положении фокусировки для различных объективов, а также наблюдаемость объекта калибровки - проточного цитометра диаметром 6 мкм. Схема осветителя образца с применением светодиода GNL-50113UBC и плосковыпуклой линзы с ФР 40 мм позволила повысить уровень засветки в 2 раза и снизить мощность питания. Методика транспортировки и хранения клеток образцов тканей человека для исследований методом ЛИМ обеспечивает поддержание 60-70%-ой жизнеспособности клеток. Методика пробоподготовки клеток включает обработку и получение из ткани методом биопсии суспензии жизнеспособных (не менее 60%) клеток. Дисперсия флуктуаций оптической толщины клеток (данные ЛИМ) позволяет выявить живые и мертвые клетки. Разработаны и протестированы компьютерные модели поровой структуры нано- и микропористых материалов носителей лекарственных препаратов и проведено компьютерное моделирование переноса противоопухолевых антибиотиков в поровом пространстве пор нано- и микропористых материалов.

Выполнены патентный и аналитический обзоры современной научно-технической, нормативной и методической литературы в технической области методов диагностики опухолевых новообразований и оценки эффективности действия противоопухолевых препаратов с использованием лазерной микроскопии, термографического анализа, флуоресцентного анализа, включая более 100 научно-информационных источника за период 2013–2017. На основании выполненного аналитического обзора сделан выбор направлений исследований и возможных вариантов технических решений, которые включают: разработку аппаратуры и программного обеспечения для получения комплекса экспериментальных данных, необходимых для выявления закономерностей развития онкологических заболеваний с целью разработки методов ранней диагностики рака и последующего выбора стратегии лечения; выявление основных признаков патологических изменений морфометрических параметров клеток для ранней диагностики онкологических заболеваний с использованием методов лазерной интерференционной микроскопии (ЛИМ) и инфракрасной термографии; создание научно-методического подхода по оценке эффективности вновь разрабатываемых противоопухолевых препаратов с использованием нано- и микропористых носителей лекарственных средств методом лазерной интерференционной микроскопии. Выполненный анализ научной и патентной литературы по тематике проекта, а также результаты собственных исследований авторов проекта позволяют прогнозировать получение новых технических решений в результате разработки и исследовательских испытаний с использованием новых программных комплексов блока термографической диагностики программно-аппаратного комплекса для ранней диагностики злокачественных опухолей и анализа эффективности действия противоопухолевых препаратов методами лазерной интерференционной микроскопии и инфракрасной термографии (ПАК), а также модуля револьверной головки блока лазерной интерференционной микроскопии, совмещенного с модулем флуоресцентного анализа для исследования морфологии и динамики флуктуаций клеточных структур. В свою очередь, определение оптимальных технологических параметров технологии изготовления платформ с пористым носителем, обеспечивающих формирование заданных характеристики пористой структуры, обеспечит получение носителей лекарственных средств для разработки лабораторной методики оценки эффективности действия противоопухолевых препаратов методом ЛИМ.

В результате экспериментальных исследований разработаны и апробированы методы термографической съемки молочной железы с использованием блока ТГД ПАК, предварительной обработки тепловых изображений молочной железы, построения мультифрактального спектра и фазового портрета. Для получения критерия классификации нормальной и раковой ткани молочной железы применялся статистический анализ на основе двухвыборочного непараметрического критерия Уилкоксона-Манна-Уитни и проводился корреляционный анализ методом Спирмена. Разработан программный модуль (в виде отдельных компонентов (классов) на высокоуровневом языке программирования MATLAB), который позволяет загружать, фильтровать (по пространству и времени в определенном частотном диапазоне), анализировать флуктуации поверхностной температуры молочных желез человека. Сохранение всех результатов производится в формате xls (файл Excel). Разработанная методика диагностики рака молочной железы с использованием блока ТГД ПАК была апробирована и проведено сравнение с клинико-лабораторными исследованиями.

Созданы методики анализа динамики изображений ЛИМ и дифференциации нормальных и опухолевых клеток. Предложен критерий дифференциации нормальных и опухолевых клеток устанавливающий, что эпителиальная клетка человека считается опухолевой, если значение показателя Хёрста превышает значение 0,45 и ширина мультифрактального спектра равна 0. В противном случае клетка считается нормальной.

Для дифференциации выделенных из одного источника (ткани, органа) раковых и нормальных эпителиальных клеток определен критерий, базирующийся на оценке морфометрических параметров фазовых изображений, полученных с помощью метода ЛИМ.

Разработанная методика получения носителей лекарственных препаратов на основе кальций-фосфатных соединений позволяет получать методом микродугового оксидирования кальций-фосфатные покрытия на подложках из титанового сплава ВТ1-0 с пористой структурой, состоящей из нижнего оксидного подслоя и основного пористого кальций-фосфатного слоя, содержащего на поверхности сфероидальные структурные элементы с открытыми проницаемыми порами. Общая пористость составляет 30–40 %, средний размер пор составляет 1–15 мкм.

Разработанная методика получения носителей лекарственных препаратов на основе кремния позволяет получать методами химического и электрохимического травления образцы с пористой структурой. Общая пористость составляет 50–80 %, поперечный диаметр пор находится в диапазоне 10–50 нм.

Разработана эскизная документация и изготовлен лабораторный стенд для оценки эффективности действия противоопухолевых препаратов методом лазерной интерференционной микроскопии ФПВК.941416.001.

Разработаны макеты модуля флуоресцентного канала и револьверной головки блока ЛИМ ПАК, подготовлена эскизная конструкторская документация модулей и проведены исследовательские испытания модулей. На основе данных исследовательских испытаний разработанных макетов модулей блока ЛИМ ПАК, подготовлены технические рекомендации для максимального интегрирования данных компонентов в систему ЛИМ ПАК.

Разработаны компьютерные модели поровой структуры нано- и микропористых материалов носителей лекарственных препаратов. Данные модели могут быть использованы для получения параметров поровой структуры носителей лекарственных препаратов для корректного анализа эффективности их действия.

Сравнительный анализ результатов измерений тестовых объектов показал, что, по сравнению со сканирующим интерференционным профилометром ZYGO NewView 5010, блок ЛИМ ПАК удовлетворяет требованиям технического задания по техническим характеристикам:точность позиционирования в плоскости (X, Y) не хуже 300 нм; разрешающая способность в плоскости (X, Y) не хуже 100 нм; разрешающая способность в направлении Z не хуже 0,2 нм; частота кадров не менее 20 Гц; диапазон сканирования (по оси Z) не менее 10 мкм; размер кадра не менее 740х480 пикселей; потребляемая мощность не более 2 кВт, демонстрируя лучшую разрешающую способность в плоскости (X, Y) и позволяя точнее измерять высоту объектов с характерным размером 1,5 мкм и менее.

Разработаны и испытаны программные модули обработки данных флюоресцентного анализа клеток ПАК, а также анализа динамики их изображений и морфометрических данных для ранней диагностики злокачественных опухолей и анализа эффективности действия противоопухолевых препаратов методами ЛИМ и инфракрасной термографии. Описанные алгоритмы реализованы в программном модуле в виде отдельных компонентов (классов) на высокоуровневом языке программирования MATLAB. Программные модули позволяют загружать оптическое изображение клетки (*.bmp, *.jpg, *.tiff), выделять и загружать, фильтровать (по времени в определенном частотном диапазоне) флюоресцентный образ клеток молочных желез человека, а также загружать, восстанавливать фазовые сдвиги, удалять наклон, выделять контур фазового изображения и анализировать морфометрические показатели и флуктуации оптической толщины клеток. Сохранение всех результатов производится в формате xls (файл Excel).

Разработана лабораторная методика оценки эффективности действия противоопухолевых препаратов с использованием метода ЛИМ и разработанных пористых носителей препаратов на основе кремния и кальций-фосфатных соединений. Методика базируется на анализе волнистости профиля фазовых изображений клеток с помощь программного обеспечения Gwyddion. Анализ данных позволяет связать величину волнистости профиля клетки с уровнем апоптических изменений исследуемых клеток, коррелирующих с эффективностью противоопухолевого препарата.

Разработаны и изготовлены экспериментальные образцы модуля флюоресцентного анализа и модуля револьверной головки блока ЛИМ ПАК, включая эскизную конструкторскую документацию. Исследовательские испытания функционирования экспериментального образца модуля револьверной головки блока ЛИМ ПАК подтвердили стабильность работы системы переключения между увеличениями, а также разницу в положении фокусировки для различных объективов. Исследовательские испытания экспериментального образца модуля флюоресцентного анализа блока ЛИМ ПАК подтвердили наблюдаемость объекта в условиях использования в качестве объекта калибровки проточного цитометра диаметром 6 мкм. При этом техническое решение реализации схемы осветителя экспериментального образца с применением светодиода GNL-50113UBC совместно с плосковыпуклой линзой с фокусным расстоянием 40 мм позволило повысить уровень засветки в два раза с одновременным уменьшением требуемой мощности питания.

Разработанная методика транспортировки и хранения клеток образцов тканей человека позволяет сохранить жизнеспособные клетки исследуемого биоматериала в процессе подготовки к транспортировке, собственно транспортировки с доставкой в научно-исследовательскую лабораторию и первичной обработки образцов. При соблюдении условий разработанной методики, включая среду для транспортировки и температурный режим, определен оптимальный временной интервал (не более 2 часов после операционного вмешательства), в течение которого образцы ткани молочной железы сохраняют жизнеспособность (не менее 60-70%) и могут быть использованы для подготовки клеточных препаратов для исследования методом ЛИМ. Кроме того, установлены условия хранения образцов в виде клеточных проб в условиях криоконсервации (−196°C, 8 часов), позволяющие сохранить жизнеспособность клеток на уровне 60%, что удовлетворяет требованиям для исследования методом ЛИМ.

Установлено, что метод механической дезагрегации образцов тканей молочной железы человека (биопсия) с получением единичных (обособленных) клеток с уровнем жизнеспособности более 60% из образцов тканей молочной железы человека, представленных как плотными, так и мягкими структурами, позволяет осуществить оптимальную пробоподготовку клеточных образцов для анализа с помощью ЛИМ ПАК.

В результате сравнительного анализа живых и мертвых клеток на основе данных ЛИМ ПАК выбран параметр оценки состояния клетки (значение дисперсии флуктуаций оптической толщины клеток) и определено его критическое значение (7 нм2), позволяющие идентифицировать живые / мертвые клетки без специальной фиксации и окраски клеточных образцов.

Разработаны компьютерные модели поровой структуры носителей лекарственных препаратов и на примере противоопухолевых антибиотиков доксорубицина и бензилпенициллина проведено компьютерное моделирование диффузии лекарственных препаратов из пор носителей на основе кремния и кальций-фосфатных соединений, получены оценочные значения коэффициента диффузии. Показано, что с увеличением размера поры величина коэффициента диффузии нелинейно возрастает и выходит на насыщение при размерах пор, превышающих 0,3–0,4 мкм.

В связи с получением результатов интеллектуальной деятельности, способных к правовой охране, были выполнены дополнительные патентные исследования, которые показали, что известные источники информации не нарушают новизну и охраноспособность сведений о результатах интеллектуальной деятельности, полученных в рамках настоящего ПНИЭР.

Работы выполнены на высоком научно-техническом уровне, полученные результаты соответствуют техническому заданию и плану-графику исполнения обязательств.

3 Охраноспособные результаты интеллектуальной деятельности (РИД), полученные в рамках проекта

На отчетном этапе зарегистрированы охраноспособные РИД, включающие ноу-хау «Способ получения носителей лекарственных препаратов на основе пористых микродуговых кальцийфосфатных покрытий» и две программы для ЭВМ «Программный модуль для анализа фазовых изображений раковых и нормальных клеток» и «Программный модуль для анализа флуктуаций оптической толщины раковых и нормальных клеток».

4 Назначение и область применения результатов проекта

Результаты проекта по разработке отечественных инновационных программно-аппаратных средств для ранней диагностики онкологических заболеваний и оценки эффективности противоопухолевых средств вносят значимый вклад в реализацию приоритетов Стратегии научно-технологического развития России в части перехода к персонализированной медицине, высокотехнологичному здравоохранению и технологиям здоровьесбережения.

5 Эффекты от внедрения результатов проекта

Организация производства программно-аппаратных комплексов на территории РФ приведет к повышению эффективности неинвазивной диагностики и терапевтических методов лечения, сокращению сроков лечения и снижению затрат медицинских учреждений на закупку медицинских изделий, позволит обеспечить импортонезависимость отечественного здравоохранения от поставок дорогостоящего оборудования и препаратов, а также увеличить объемы экспорта российской высокотехнологичной продукции.

6 Формы и объемы коммерциализации результатов проекта

Коммерциализация результатов проекта позволит создать высокотехнологичный наукоемкий продукт – программно-аппаратный комплекс для ранней диагностики злокачественных опухолей и анализа действия противоопухолевых препаратов (ПАК), востребованный в здравоохранении и в области биомедицинских исследований. Создание производства на базе Индустриального партнера позволит увеличить долю российской продукции на отечественном рынке оборудования лазерной интерференционной микроскопии и сопутствующего оборудования к 2024 г. до 2,5 % (в настоящий момент около 1 %). По данным агентства BCC Research, объем мирового рынка микроскопии и сопутствующего оборудования для биомедицинских приложений в 2018 году превысил $7,0 млрд, а в 2019 – $7,1 млрд (доля российского рынка менее 0,1%). Техническо-экономические характеристики планируемой к производству продукции проекта обеспечивают ее конкурентные преимущества перед импортными аналогами. Прогнозируемая стоимость ПАК на 30 % ниже импортных аналогов, что обеспечивает конкурентоспособность продукта на внутреннем и на внешних рынках. Вывод на рынок создаваемых на основе результатов проекта программно-аппаратных комплексов планируется осуществить в 2021 г.

7 Наличие соисполнителей

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физики прочности и материаловедения Сибирского отделения Российской академии наук